研究室での信頼性の高いQpcr結果のための主要な技術

定量PCR（qPCR）とリアルタイムPCRは分子生物学における基本的なツールですが、その違いと応用については混乱が残っています。この包括的なガイドでは、これらの技術を明確にし、信頼性の高い実験結果を得るためのベストプラクティスを探ります。

qPCRとリアルタイムPCRは、しばしば互換的に使用されますが、同じ技術のわずかに異なる側面を表しています。

• リアルタイムPCR は、蛍光検出によるDNA増幅のリアルタイムモニタリングを強調しています。
• qPCR は、核酸の定量分析、つまり初期テンプレート濃度の決定に特化しています。

どちらの技術も、増幅が起こるにつれて追跡できるため、増幅後のゲル電気泳動の必要がなくなり、分子診断に革命をもたらしました。

閾値サイクルは、定量分析における重要なパラメータを表します。

• Ct（閾値サイクル）：蛍光がバックグラウンドレベルを超えるサイクル数を表す従来の用語です。
• Cq（定量サイクル）：測定の定量的な性質をより正確に反映した現代の用語です。

低いCt/Cq値は、より高い初期テンプレート濃度を示し、適切な標準と組み合わせると相対的および絶対的な定量化が可能になります。

標準的なPCRの原則が適用されますが、qPCRではより厳格なプライマー要件が求められます。

• 18〜25塩基対の長さ
• 40〜60％のGC含有量
• 60〜65℃の融解温度
• 二次構造の形成を最小限に抑える

• プローブベースのアッセイのプローブ適合性
• オフターゲット結合を最小限に抑えるための特異性の向上
• プライマーダイマーの形成を防ぐための最適化された配列

リアルタイムPCRは、分子分析に大きな改善をもたらします。

• PCR後処理なしでの正確な定量化
• シングルコピー数までの検出感度
• 密閉チューブ形式により汚染リスクを軽減
• 7〜8桁のダイナミックレンジ
• 同時ターゲット検出のための多重化機能

最新のPCRバリアントは、さまざまな研究ニーズに対応します。

ゲル電気泳動による定性分析のためのエンドポイント検出。

蛍光検出による正確な定量化を可能にする動的モニタリング。

標準曲線要件を排除し、制限希釈とポアソン統計による絶対定量化。

これらのアプローチは、異なる実験的課題に対応します。

• ネステッドPCR は、2つのプライマーセットによる逐次増幅により特異性を高めます。
• リアルタイムPCR は、増幅プロセス全体で定量データを提供します。

最適なシステム性能のための主な要素には以下が含まれます。

• サンプルスループット容量
• 検出感度とダイナミックレンジ
• 多重アッセイの光学構成
• 熱的均一性とサイクリング速度
• データ分析ソフトウェアの機能

リアルタイムPCRは、さまざまな科学的および臨床的応用に使用されています。

• 研究における遺伝子発現プロファイリング
• 病原体検出とウイルス量定量化
• がん診断におけるオンコジーン変異分析
• 創薬におけるファーマコゲノミクス研究
• 農産物におけるGMO検出
• 法医学分析と遺伝子検査

この技術は、プローブ化学、機器、データ分析方法における革新により進化を続けており、生命科学研究および分子診断における不可欠なツールとしての地位を確固たるものにしています。