従来のPCRが分子生物学の"拡大鏡"として機能している場合,リアルタイム定量PCR (qPCR) は精密な"顕微鏡"として機能します." この先端技術では 標的遺伝子配列を 増幅するだけでなく 増幅プロセスをリアルタイムで 追跡します "遺伝子発現レベルを正確に定量化できる.エンドポイントPCRの粗略な推定値からリアルタイムPCRの精度と効率への移行は,現代の分子生物学研究における避けられない進化を表しています.
分子生物学における革命的な技術である ポリマレス連鎖反応 (PCR) は シーケンス特異性オリゴヌクレオチドプライマー 耐熱DNAポリマレス特定のDNAやcDNA配列を指数的に複製するために百万倍もの増幅を達成します Traditional endpoint PCR requires post-reaction detection and quantification through gel electrophoresis and image analysis—a time-consuming process with limited precision that struggles to meet growing demands for quantitative analysis.
リアルタイムQPCRは,PCRサイクルごとに製品生成を監視することで,この景観を変えました.研究者は,最初の標的配列量を 極めて正確に決定することができますPCRは理論的には各サイクルで標的分子を倍にするが,サイクル数とエンドポイント製品の測定を通じて出発物質を定量化するための初期の試みは信頼性がないことが判明した.リアルタイムQPCRは,強力な定量化ニーズを満たすために登場しました,エンドポイントPCRは,DNAの特定の断片を配列化,クローン化,および他の分子生物学アプリケーションのために増幅するために主に有用である.
この技術では,PCR製品 (アンプリカン) に結合する熒光染料を用いて,各サイクル後にDNA含有量を測定する.初期テンプレートの金額をシグナル変化のモニタリングによって定量化できるようにする常見なフラウレッサントレポーターには,以下が含まれます.
特殊機器は,熱循環と熒光スキャンを組み合わせて,放大曲線 (図1) を生成し,周期数に対する熒光強度をグラフ化します.PCR プロセス全体にわたる製品蓄積を表す.
この技術はDNA/RNAの検出と定量化における ゴールドスタンダードとなり 6〜8階位のダイナミック範囲で 2倍の精度を達成しています
標準的なリアルタイムPCRプロトコルは40サイクルを運行し,それぞれに以下が含まれます.
高温 (通常は95°C) で発育すると,二重鎖DNAが単一鎖に溶け,二次構造が破壊される.GCが豊富なテンプレートには長時間のデナチュレーションが必要である.
補完的配列はプライマーの溶融温度 (Tm) 以下の5°Cの温度で交配する.
DNAポリメラーゼは70°C~72°Cで最適に作用し,プライマーを最大100ベース/秒の速度で拡張する.小型のアンプリカンでは,このステップは60°Cで焼却を組み合わせることが多い.
このアプローチでは,まず RNA を cDNA に逆転転写酶 (RT) を使ってランダム,オリゴ (dT) または遺伝子特異型プライマーで逆転転写する.その後,約10%のcDNAがリアルタイムPCRのために分離チューブに移されます.利点は以下の通りです
cDNA合成とPCRを単一のチューブで組み合わせることで,汚染リスクと処理エラーが減少します.この方法は,非特異的な製品を防ぐために遺伝子特異的なプライマーを必要とします.高出力アプリケーションに最適化.
リアルタイムのPCRは以下の重要な機能を果たします.
デジタルPCRや高解像度メルト分析のような新興技術は リアルタイムPCRアプリケーションを拡大すると約束しています 次世代の機器は 感度,速度,データの分析能力将来の応用には,個人化医療,環境監視,リアルタイムPCRを科学進歩と公衆衛生にとって不可欠なツールとして.
コンタクトパーソン: Ms. Lisa
Japanese
