ブログ について 核酸抽出キットの主要原則とトラブルシューティング

核酸抽出は 分子生物学実験の礎石として機能します しかし 商業的な抽出キットの大量に 直面すると多くの研究者は困惑しています予期せぬ結果のトラブルシューティングでは特に. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable効率的なプロセスです

細胞溶解,核酸結合,洗浄と浄化,乾燥そして最終エルーション各ステップは前のステップの上に構築され 誤ったステップは 抽出全体に 影響を及ぼします

効果的な細胞溶解は重要な第一歩です DNAかRNAを抽出するかどうかに応じて溶解バッファの配列が異なりますしかし,通常は二重目的を持つ高濃度のカオトロプ塩を含んでいる.:

• タンパク質デナチュレーション:これらの塩は,水素結合,ヴァン・デル・ワールス力,水害反応を乱し,タンパク質 (核酸を含む) を不安定化し,核酸分解を防ぐ.
• シリカ結合を容易にする:カオトロプは,水分を核酸から移動させ,シリカ膜への転送に最適な条件を作り出す.

一般的なカオトロプ塩は,グアニジンヒドロクロリド,グアニジンチオシアナート,尿素,リチウムパークロラートなどである. 洗浄剤はタンパク質溶解と細胞溶解を助けるために頻繁に追加される.サンプル種類によってタンパク質酶Kは,特にデナチュレーション条件下で,核酸製剤のタンパク質を効果的に消化する.リソzymeは,もう1つの一般的な酵素である.しかし,その活性性は,デナチュレーション条件下では減少します..

プラズミド抽出は,RNAまたはゲノムDNA分離とは著しく異なる.重要な違いは,最初にプラズミドDNAをゲノムDNAから分離することにある.カオトロプ塩分をすぐに加えると 全てのDNA型が無差別に放出されますしたがって,プラズミドプロトコルは,通常,初期細胞溶解後にカオトロプを導入する.

溶解以外にも,カオトロプ塩は,シリカ柱への核酸結合を促進する.エタノール (または時にはイソプロパノール) は,この結合を強化する.シリカ 柱 は,塩分 濃度 や 他 の 要因 に かかっ て DNA や RNA に 選択 的 に 結合 する 樹脂 を 含ん で いる塩基酸は高純度で,クローンや長読配列化などに適しています.

エタノール濃度は極めて重要であることが判明.過剰なエタノールは,分解物質と小さな分子を沈殿させ,A260吸収度値に影響を与えます.エタノールの不足は,膜から塩の除去を妨げる可能性があります.キットで提供されるエタノール量は事前に最適化されていますが,DNA分解がA260読み上げを歪めるように見える場合は,エタノール濃度の再最適化が役立ちます.流通溶液は,失われたヌクレイン酸を回復するために降水のために保存することができます.SDS を含有する洗剤が溶解に使用される場合,NaClは洗剤汚染を避ける効果的な降水剤として機能します.

シリカ膜を通してリサートを遠心させた後,標的ヌクレイン酸は柱に結合し,タンパク質とポリサカリドは流通中にとどまります.しかし,膜は残留タンパク質と塩分を保持する植物サンプルにはポリサカリドや色素が残る.血液サンプルではしばしば茶色または黄色い色が変化する.洗浄手順ではこれらの汚染物質が除去されます.

典型的には2回洗い,正確な数はサンプル種類によって異なります.最初の洗いには,通常,残留タンパク質や色素を除去するための低濃度カオトロプが含まれます.塩分を除去するためにエタノール洗浄初期にタンパク質が少ないサンプル (例えばプラズミド準備またはPCR製品浄化) はエタノール洗浄のみを必要とする場合があります.高産量と純度のためにカオトロップを完全に除去することが不可欠です.いくつかのキットは,エタノールで洗うことを推奨します.残留塩は溶解を阻害し,生産量を低下させ,A230値を増やし,A260/230比率を下げます.

ほとんどのプロトコルは,洗浄後の遠心分離により,柱から残留エタノールを乾燥させます.このステップはクリーンエルーエートにとって極めて重要です.10mMのトリスバッファまたは水を加え,その後,膜を放出するために核酸を再水化します.エタノール残留は 完全なる再水化と溶解を防ぐ指示的な兆候は,アガロースゲルプーンに収束できないサンプル (塗料が入っている場合でも) または -20°Cで凍結できないもの.

DNA抽出の最終段階では,シリカから純粋な核酸が放出されます.DNAでは,pH 8-9で10mM Trisが標準です.DNA は 弱い アルカリ pH で より 安定 し て おり,水 より 緩衝 物質 で より 早く 溶け ます塩基配列の塩基配列は,塩基配列の塩基配列の塩基配列の塩基配列を構成する.バッファーは,遠心分離前に数分間膜の上に座らせます高分子量DNAを完整に必要とするアプリケーション (例えば,長読配列化) では,エルーションバッファが最適です.RNAは酸性PHを弱く許容し,水に容易に溶解します.水を好ましい稀释剤にする.

標準的なプロトコルに従ったとしても 抽出には様々な問題があります

• 低収量通常は不完全な溶解または不適正な結合条件から生じる.バッファ稀释と結合ステップのために常に新鮮で高品質の無水エタノールを使用します.劣質または古いエタノールは水分を吸収する洗浄バッファが正しく準備されていない場合,抽出されたヌクレイン酸を剥がすことができます.
• 純度が低いタンパク質汚染は,過剰な出発材料が不完全な溶解のリスクを増加させる結果である.低A260/230比率は,通常,残留塩または不十分な洗浄を示す.洗浄バッファに最高品質のエタノールを使用する洗浄手順を追加してください.
• 汚染物質:環境サンプルは,DNAと共同浄化し,シリカ柱の除去に抵抗するヒウム物質に特に敏感であることが判明しました.特殊技術により,列結合の前に,干渉するタンパク質とヒュミックが除去できます.
• 劣化:RNAは,典型的には不適切なサンプル保存や非効率的なリゼス (RNaseフリー水を使用すると仮定) から,より大きな分解リスクに直面しています.分解はPCRアプリケーションでは重要ではなく,高分子量DNAを完整に必要とする長読配列化には重要になります!
• PCR製品の浄化:厳密にDNA抽出ではないが,これは言及に値する.通常,スピン列浄化の前にPCR反応体積ごとに3〜5ボリュームの塩溶液が加わります.失敗した浄化が PCR の失敗から生じる透明なPCR帯が列に結合しない場合,復元と再浄化のために流通状態に残る可能性があります.

不完全な溶解は,予想外の低収量,不完全なタンパク質溶解,またはA260/230比率が悪い形で表される可能性があります.これは,抽出中に特定のサンプル成分が完全に溶解したり溶解しなかったことを示唆しています.欠陥溶解と汚染や分解を区別するには,溶解バッファの組成,潜伏パラメータ,物質を妨害する可能性があります例えば,A260/230比率が悪い場合,不完全な溶解ではなく,結合後の残留塩や洗浄不足を示す可能性があります.不完全なリジスに対処するには,リジスバッファの構成要素を最適化する必要があります., 潜伏時間,または追加的な機械的/酵素溶解方法を組み込む.

特殊技術では,環境サンプルから,ヌクレイン酸で共同浄化できるヒューミック物質および他の干渉物質を除去することを目的としています.シェラティング剤を含む特殊な抽出バッファ (e選択的にカチオンを結合し除去する.微分遠心分離や過濾などの事前処理方法は,核酸抽出前に環境サンプルからより大きな粒子を除去するのに役立ちます結合段階での干渉を減らす.

特定のサンプル (例えば組織や脂質豊富な材料) は,特定の課題を提示します.組織サンプルには,完全なリシスとヌクレイン酸の放出を確保するために,しばしば追加の機械的破壊または酵素的消化が必要である.. 脂質豊富なサンプルは,脂質が列マトリックスへのヌクレイン酸結合を妨げるため,浄化が複雑になる可能性があります.これらの課題に対処するには,リゼスバッファ組成を変更する必要があります.浄化プロトコルの最適化特別に設計されたキットを使用します.

2010年6月28日に発行. 2021年5月および2024年3月にレビューおよび再発行.