PCR、RT-PCR、およびqPCR技術の説明ガイド

実験室での"PCR"",RT-PCR"",qPCR"という用語に 戸惑ったことはありますか? 心配しないでください. この記事では,これらの技術間の違いを シンプルな言葉で明確に説明します.研究 を より 効率 的 に 進める ため に.

PCR,またはポリマレス連鎖反応は DNAの"コピー機"のように機能します この基本的な分子生物学技術,カリー・マリスによって発明されました数 時間 の 間 に 数百万 から 数十億 の 印刷 機 を 生産 するPCRは遺伝子クローン,DNAシーケンシング,疾患診断,その他多くの応用に不可欠です

PCRプロセスは,指数関数DNA増幅を可能にする 3 つの繰り返しのステップで構成されています.

1. デナチュレーション:高温 (94~98°C) で二重鎖DNAを単一鎖に切り離します
2. 焼却:温度減少 (50~65°C) はプライマーの結合を補完標的配列に可能にします.
3. 延長:DNAポリマレス (典型的にはTaqポリマレス) は72°Cで新しい補完鎖を合成する.

25~40サイクル後,増幅DNAはアガロースゲル電解を用いて可視化することができる.

定量PCR (qPCR) またはリアルタイムPCRは,初期DNAテンプレートの量を定量化しながら,リアルタイムで増幅をモニターするために,熒光検出を組み込むことで,従来のPCRをベースにしている.

主要なフラウレセンスの検出方法は2つあります.

• DNA結合染料 (例えばSYBRグリーン):費用対効果が高くても 異質性がない 双鎖DNAをすべて結合させる
• 発光探査機:ターゲットに特化したものですが もっと高価で 特別設計の探査機が必要です

鍵となるqPCRメトリックは,Ct (しきい値サイクル) 値である. フレウorescenceが定義されたしきい値を超えたときのサイクル番号である.Ct値が低い場合は,初期テンプレートの濃度が高くなります.

応用には以下が含まれます.

• 遺伝子発現分析
• 病原体検出
• 薬物検診
• 癌に関する研究

リバーストランスクリプションPCR (RT-PCR) は,まずリバーストランスクリプターゼを使用してRNAを補完DNA (cDNA) に変換し,その後標準PCRによってcDNAを増幅します.これは,以下を含むRNA分析を可能にします.

• 遺伝子発現研究
• RNAウイルスの検出 (HIV,インフルエンザなど)
• RNA構造/機能に関する研究

リアルタイム定量RT-PCRは,RNA発現レベルを定量化するために,リバーストランスクリプションとqPCRを組み合わせます.このゴールドスタンダード方法は,以下に広く使用されています:

• 精密な遺伝子発現測定
• マイクロRNA 量化
• 長い非コーディングRNA研究

qPCRは特異性を確保するために注意深く設計されたプライマーと探査機を必要とします.不一致は誤った結果につながる可能性があります.

異なる酵素 (例えば,AMV,M-MLV) は,熱安定性と効率性によって異なるため,cDNA出力を影響する.

非特異的な増幅は,最適化された焼却温度と高精度ポリメラスによって最小限に抑えることができる.

これらの分子技術の違いを理解することで 研究者は,正確な信頼性の高い結果を確保し, 特定の実験ニーズに適した方法を選択することができます.