リバーストランスクリプション定量ポリマレス連鎖反応 (RT-qPCR) は 敏感で効率的なRNA定量化のための強力なツールとして登場しました世界各地の研究室で 遺伝子発現分析を 革命的に変えるこの包括的なガイドは,この不可欠な技術の基本原理と実践的な応用を調査します.
RT-qPCRは,RNAを補完DNA (cDNA) に逆転写し,定量的なPCR増幅を組み合わせます.各PCRサイクルの間,フラウレセンスの検出によりRNA濃度を正確に測定できるようにする.遺伝子発現研究,病原体検出,疾患研究で広く応用されている この技術は,比類のない敏感性と特異性を提供しています
研究者は2つの主要な方法論 (図1,表1) のいずれかを選択しなければならない. 一段階の方法は,1つのチューブで逆転写とPCR増幅を実行する.2段階のアプローチでは,これらのプロセスをそれぞれの段階に最適化された条件で異なる反応に分けます..
| 方法 | 利点 | 欠点 |
|---|---|---|
| 一つのステップ |
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| 2つのステップ |
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mRNAはわずかに高い感受性を有しますが,RNA総数は通常,初期細胞数に対する優れた定量回復とより良い正常化を提供します.mRNA濃縮ステップの除去は,異なるmRNA回復率からの潜在的なバイアスを防ぐ.比較的定量化が重要なほとんどのアプリケーションでは,総RNAが好ましい選択となります.
2段階RT-qPCRは4つのプライマーアプローチを提供しています (図2,表2):
| プライマーの種類 | 特徴 | 申請 |
|---|---|---|
| オリゴ (dT) | ポリ (A) 尾を標的にし,全長 cDNA を生成する | 限られた出発材料,3' 末期分析 |
| ランダムプライマー | RNAトランスクリプト全体に結合する | 構造化されたテンプレート;包括的なプロファイリング |
| シーケンス特異性 | ターゲットシーケンスに合わせた | 高特異性のアプリケーション |
重要な酵素特性には,構造化されたRNAテンプレートの効率的なトランスクリプションのための熱安定性および適切なRNase H活性レベルが含まれます.RNase H の活動が最小限である一方で,長いトランスクリプト生成が有利である.初期PCRサイクルの間にRNA-DNAデュプレックス溶解を促進することで qPCRの効率を高めます.
QPCRプライマーの最適は 染色体DNAの増幅を防ぐために エクソン・エクソン・ジャンクションを横切るべきですゲノムDNAの干渉を排除するためにDNase治療が不可欠になる.
"no-RT"コントロールは,DNA汚染を検出するために逆転写字酶を省略することで,重要な品質チェックとして機能します.このコントロールのあらゆる増幅は,実験結果に悪影響を及ぼす 汚染DNAの存在を示します.
これらの技術的パラメータを慎重に検討することで,研究者はRT-qPCRの潜在能力を完全に活用し,複製可能な遺伝子発現データにより 様々な分野における科学的理解が向上します.
コンタクトパーソン: Ms. Lisa
Japanese
